受到新冠疫情的影響，今年的CLSIM100更新姍姍來遲。而今年又有哪些重要更新，接下來讓我們一起來了解一下。

01

全彩正文，關(guān)鍵信息更明確

翻開CLSI正文，第一感覺就是所有表格變成了全彩，凸顯了關(guān)鍵信息。

如所有表頭、標題、各種分格等全部變成了彩色，關(guān)鍵信息更加突出。

02

血培養(yǎng)報陽后直接紙片擴散法檢測

雖然2019年EUCAST推出了血培養(yǎng)報陽快速藥敏檢測——RAST實驗，但是EUCAST藥敏體系本身和CLSI存在一定差異，如結(jié)果解釋、折點包括紙片含量等均與CLSI不同，妨礙了此方法的推廣和使用。今年CLSI就此增加了相關(guān)內(nèi)容，為加速血培養(yǎng)報告，縮短藥敏報告TAT，提供了一個相對可靠、標準的方法。

目前此方法僅適用于腸桿菌目細菌，適用藥物也只有氨芐西林、氨曲南、頭孢他啶、頭孢曲松、妥布霉素和復(fù)方磺胺6種，和EUCASTRAST比較，測試的菌株種類和藥物數(shù)量都比較少，同時缺少治療血流感染非常關(guān)鍵的碳青霉烯類藥物。

具體的操作流程如下

1

對于革蘭染色為陰性的血培養(yǎng)瓶，取報陽8小時以內(nèi)的血瓶，上下顛倒5-10次充分混勻；將血培養(yǎng)瓶蓋消毒，并插上20G（國內(nèi)標準為7#）排氣針，向MH瓊脂滴加4滴血培養(yǎng)報陽后肉湯，涂布均勻（參考KB法MH瓊脂的涂布方式）；同時需要接種血平板進行純培養(yǎng)，確認其純度。

2

涂布完成后將其半開蓋3-5分鐘（不要超過15分鐘），貼上抗生素的紙片。

3

在15分鐘內(nèi)放孵育箱倒置進行孵育。

CLSI建議16-18小時后，按照CLSIM02的要求量取抑菌圈直徑，并使用M100中的表格2A中的折點進行解釋報告，CLSI目前尚未完成對于短時間（如8-10小時）讀取抑菌圈準確性和折點的評估。

檢測結(jié)果

如果生長出現(xiàn)異常（如，混合接種、非融合生長、生長微弱導至無法讀取），不要解讀直接紙片擴散法的抑菌圈直徑和結(jié)果解釋，而需要直接報告純培養(yǎng)后執(zhí)行的標準藥敏的操作。

如果發(fā)現(xiàn)雙重抑菌環(huán)，或抑菌圈內(nèi)存在菌落，首先需要檢查純度平板，確認純度。

如果為純培養(yǎng)則讀取內(nèi)圈。

質(zhì)控方面和EUCAST不同，對于直接紙片擴散法測試，CLSI沒有提出一套完整的質(zhì)控流程，仍然沿用現(xiàn)有的質(zhì)控方法。CLSI建議使用大腸埃希菌ATCC25922按照M02的要求進行質(zhì)控。后續(xù)會有更為詳細的CLSI血培養(yǎng)陽性快速藥敏的方法細節(jié)解讀，并就CLSI和EUCAST2種快速藥敏方法的差異進行對比，供大家參考。

雖然從目前來看CLSI對于血培養(yǎng)陽性快速藥敏還存在諸如使用范圍較窄、藥物種類偏少、不支持快速藥敏讀取等問題，但是至少規(guī)范了血培養(yǎng)報陽以后如何進行KB法藥敏測試的操作方法。隨著評估工作的進一步深入和發(fā)展，此方法的適用范圍、快速結(jié)果判斷等內(nèi)容也會陸續(xù)更新。

而在實際工作中，VITEK2的藥敏檢測在8-12小時內(nèi)。如果實驗室可以合理規(guī)劃藥敏檢測的時間，結(jié)合中國卡覆蓋藥物的優(yōu)勢，同樣可以向臨床提供快速藥敏服務(wù)。

03

折點相關(guān)更新

a)葡萄球菌苯唑西林

自從2016年以來，幾乎每年都會對葡萄球菌耐甲氧西林（苯唑西林）的折點進行更新（見下表所列），今年也不例外:

如下圖總結(jié)，今年金黃色葡萄球菌和路登葡萄球菌以外的葡萄球菌屬的苯唑西林MIC折點進行了更新，向上增加了1個對倍稀釋度，敏感折點從0.25μg/mL上調(diào)至0.5μg/mL。并且對而后的注釋進行了相應(yīng)的調(diào)整。但是頭孢西丁紙片法的折點沒有變更。

目前CLSI中對于葡萄球菌耐甲氧西林的檢測非常復(fù)雜，目前有5種表型檢測方法：頭孢西丁MIC法、頭孢西丁紙片擴散法、苯唑西林MIC法、苯唑西林紙片擴散法以及苯唑西林鹽瓊脂法。同時不同的葡萄球菌所使用的表型檢測方法也有很大的差異，見下表：

這樣造成了表格非常臃腫，就葡萄球菌而言，僅苯唑西林的折點表格就有3頁。為此新版CLSI重新總結(jié)了葡萄球菌耐甲氧西林的檢測表格，將1張大表分為2張小表，表格3G-1針對金黃色葡萄球菌和路登葡萄球菌，可用頭孢西丁MIC法和頭孢西丁紙片擴散法；苯唑西林【上海九院供卵試管】MIC法和苯唑西林鹽瓊脂法4種表型測試方法；表格3G-2針對金黃色葡萄球菌和路登葡萄球菌以外的葡萄球菌，可用頭孢西林紙片法，苯唑西林紙片法和MIC法來進行檢測。

目前VITEK2對于葡萄球菌的耐甲氧西林的檢測，使用頭孢西丁篩選實驗（等效于頭孢西丁紙片擴散法）和苯唑西林MIC相結(jié)合的方法；而對于金黃色葡萄球菌和路登葡萄球菌以外的葡萄球菌是否需要調(diào)整苯唑西林MIC折點，還有待進一步的研究。

b)阿奇霉素對于志賀菌折點，以及對于淋病奈瑟菌的紙片法折點

目前腸沙門傷寒血清型和志賀菌對于阿奇霉素有了相關(guān)折點，但CLSI也增加了相關(guān)的注釋，對于志賀菌，特別是宋內(nèi)氏志賀菌紙片法抑菌圈可能會模糊，難以測量。如抑菌圈難以測量，建議使用MIC法。

對于淋病奈瑟，增加了阿奇霉素的紙片法折點。

c)Lefamulin和亞胺培南-瑞萊巴坦的折點

Lefamulin是2019年FDA批準的半合成截短側(cè)耳素類抗生素，通過通過與細菌核糖體的胎基轉(zhuǎn)移酶中心相結(jié)合，從而抑制細菌生長所需蛋白質(zhì)的合成途徑發(fā)揮抗菌作用。主要用于治療社區(qū)獲得性肺炎，抗菌譜包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌（甲氧西林耐藥菌株）、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、肺炎支原體和衣原體等。目前CLSI新增了Lefamulin針對葡萄球菌；肺炎鏈球菌和嗜血桿菌的折點。此外截短側(cè)耳素類是一個具有全新抗菌機制的新抗生素大類，其化學結(jié)構(gòu)和現(xiàn)有抗菌【上海集愛可以供卵試管嗎?】藥物有很大差異，可以對β-內(nèi)酰胺類，大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、四環(huán)素類藥物耐藥株同樣具有抗菌活性。目前針對這些細菌僅有敏感折點，沒有中介和耐藥折點。

而亞胺培南-瑞萊巴坦是針對CRE的新藥，瑞萊巴坦是一種新的β內(nèi)酰胺酶抑制劑，與阿維巴坦較為類似，可以抑制絲氨酸酶，但是對于金屬酶沒有活性。目前也在國內(nèi)進行相關(guān)的臨床實驗，有望在幾年內(nèi)推出。

今年CLSI增加了亞胺培南-瑞萊巴坦對于腸桿菌目、銅綠假單胞菌和厭氧菌的折點，并且在備注中強調(diào)，亞胺培南敏感可以推導亞胺培南-瑞萊巴坦敏感，但是亞胺培南-瑞萊巴坦敏感不能推導亞胺培南敏感。

d)其他折點相關(guān)更新

流感嗜血桿菌增加了頭孢洛扎-他唑巴坦的敏感折點（僅MIC法≤0.5/4為敏感）。

04

I^的更新

在2020年的CLSI在腸桿菌目和銅綠假單胞菌折點中，對于部分藥物的中介結(jié)果后增加了一個^符號，代表該藥物在某些解剖部位存在潛在濃集。而在今年說的更加明確，這個部位就是尿路。

對于腸桿菌目的碳青霉烯類藥物亞胺培南、美羅培南、厄他培南、多尼培南的中介折點后增加了^符號。

05

QC方面和新增抗菌藥物

對于QC表格，一般情況下大家比較關(guān)注現(xiàn)有藥物QC范圍的更新，畢竟這個直接與我們的日常工作直接相關(guān)，但是小編認為關(guān)注這個表格中的新增藥物也非常重要，對于新【廣東可以供卵的醫(yī)院】抗菌藥物上市，完善其藥敏檢測方法，確認質(zhì)控范圍是很重要的一步，因此通過這個表格了解一些即將上市的新抗菌藥物。

a)頭孢吡普（Ceftobiprole）紙片法的更新。

頭孢吡普是和頭孢羅膦類似的，具有抗MRSA活性的頭孢菌素類藥物，2008年在加拿大上市，但是目前尚未在美國和中國上市，目前CLSI對此藥物沒有相關(guān)折點，但是有MIC的操作方法和QC范圍的建議。對于紙片擴散法，原來CLSI使用30μg的紙片，但是今年調(diào)整為使用5μg的紙片，與Eucast保持一致，同時調(diào)整質(zhì)控菌株，使用大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作質(zhì)控。

b)增加Aztreonam-nacubactam和Cefepime-nacubactam的QC和MIC制備方法。

Nacubactam是一種新型的酶抑制劑，主要用于抑制腸桿菌目的絲氨酸酶（A類，C類和部分D類），同時也可以作用于青霉素結(jié)合蛋白（PBP2），具備雙重耐藥機制?？梢院皖^孢菌素以及碳青霉烯類藥物進行聯(lián)用，目前尚處于臨床實驗中。目前CLSI中與nacubactam進行配伍的藥物共有3個，分別為美羅培南、氨曲南和頭孢吡肟，隨著這些藥物的陸續(xù)上市，可能會增加折點等方面的更新。

c)阿米卡星銅綠假單胞菌紙片擴散法QC范圍的更新

阿米卡星銅綠假單胞菌紙片擴散法QC范圍從20-26調(diào)整到18-26。

06

其他相關(guān)更新

a)折點更新列表

按照慣例，CLSIM100文件會列出2010年以后折點進行的列表，在今年把這個表格分為2列，將MIC法折點更新和紙片擴散法折點更新進行分列，如下表：

可以更加明確的梳理折點變更的歷史?！竟⑨t(yī)院供卵真的很難等嗎】

b)CARBA方面的更新

2019年CLSIM100增加了附錄H用于解釋分子生物學檢測耐藥機制（MRS，VRE，CARBA，ESBL），今年對于CARBA的檢測方面增加了一頁表格，專門用于解釋當3、4代頭孢菌素敏感，但是碳青霉烯中介或耐藥這種表型時，如何進行解釋和報告。當產(chǎn)生這種表型，且CARBA陽性時，建議使用參考方法對藥敏結(jié)果進行復(fù)核。如果復(fù)核后仍然存在耐藥表型和CARBA結(jié)果不一致的情況，應(yīng)該報告相矛盾的表型和基因型結(jié)果，并給出相關(guān)的注釋“目前的臨床和實驗室數(shù)據(jù)不足以得出結(jié)論這些這些藥敏結(jié)果為S或SDD的頭孢菌素對這些產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株有效”。

此外對于CARBA的檢測靶標也發(fā)生了變更，除了KPC,OXA-48-like,VIM,NDM,orIMP5個CARBA位點以外，2021年CLSI也推薦使用mCIM和CarbaNP等碳青霉烯酶的表型實驗作為靶標。

c)金黃色葡萄球菌復(fù)合群

隨著質(zhì)譜技術(shù)，以及分子生物學方法的應(yīng)用，對于細菌分類的認識也在逐步深入中，在葡萄球菌的藥敏表格中也增加了相關(guān)內(nèi)容：

“S.aureuscomplexconsistsofthecoagulase-positivespeciesS.aureus,Staphylococcusargenteus,andStaphylococcusschweitzeri.IfS.argenteusisidentifiedbyMALDI-TOFMSorsequencing,itisrecommendedthatitbereportedas“S.aureuscomplex(S.argenteus),”andS.aureusphenotypictestingmethodrecommendations,breakpoints,andinterpretivecategoriesshouldbeused.HumaninfectionswithS.schweitzerihaveyettobereported.3”

銀白色葡萄球菌（Staphylococcusargenteus）和Staphylococcusschweitzeri以往被認為是金黃色葡萄球菌的2個變種，2015重新命名，從金黃色葡萄球菌中區(qū)分出來[1]。目前的研究也表明這2種葡萄球菌也存在細胞毒素[2]，文獻表明銀白色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌有類似的致病性，并且同樣具備SCCmec耐藥基因。如果質(zhì)譜鑒定結(jié)果為銀色葡萄球菌，CLSI建議報告為金黃色葡萄球菌復(fù)合群（銀白色葡萄球菌），使用金黃色葡萄球菌推薦的表型檢測方法，折點和結(jié)果解釋標準。而S.schweitzeri目前沒有造成人類感染的報道。

兩者最明顯的差異在于銀白色葡萄球菌因缺少操縱子crtOPQMN無法合成黃色色素呈現(xiàn)白色，但是金黃色葡萄球菌也有約10%的分離株是白色，正是這一類菌株的存在增加了區(qū)分兩者的難度。可以通過MLST或其他分子生物學的方法區(qū)分銀白色葡萄球菌，目前在國內(nèi)已經(jīng)銀白色葡萄球菌的分離報告[3]。

d)特地唑胺

此外在葡萄球菌、腸球菌和鏈球菌的表格中增加了一條特地唑胺的注釋，即“利奈唑胺敏感可以推導特地唑胺敏感，但是某些菌株即便對利奈唑胺耐藥，也有可能對特地唑胺敏感”。但是目前特地唑胺尚未在國內(nèi)上市，這條注釋和我們關(guān)系不大。

e)黏菌素硫酸鹽（Colistinsulfate）

在多黏菌素相關(guān)表格中，強調(diào)藥敏實驗需要使用的藥物為黏菌素硫酸鹽（Colistinsulfate），這個與黏菌素的藥敏測試規(guī)則相關(guān)，黏菌素治療可以甲磺酸鹽，但是藥敏實驗只能使用硫酸鹽。

參考文獻

1.TongSYC,SchaumburgF,EllingtonMJ,etal.NovelstaphylococcalspeciesthatformpartofaStaphylococcusaureus-relatedcomplex:thenon-pigmentedStaphylococcusargenteussp.nov.andthenon-humanprimate-associatedStaphylococcusschweitzerisp.nov[J].Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,2015,65(Pt1):15.

2.JohanssonC,RautelinH,KadenR.StaphylococcusargenteusandStaphylococcusschweitzeriarecytotoxictohumancellsinvitroduetohighexpressionofalpha-hemolysinHla[J].Virulence,2019,10(1):502-510.

3.ZhangDF,XuX,SongQ,etal.IdentificationofStaphylococcusargenteusinEasternChinabasedonanonribosomalpeptidesynthetase(NRPS)gene[J].Futuremicrobiology,2016,11(9):1113-1121.

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