體外受精中1PN及 0PN(2PB)胚胎發(fā)育替能及影響因素分析.doc
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1、體外受精中1PN及0PN(2PB)胚胎發(fā)育替能及影響因素分析張亞摘,殷寶莉,張翠蓮,韋多,郝好英,宋小兵,謝娟珂(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究所/河商省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究所,鄭州450003)【摘要】目的初步探討體外受精一胚胎移植周期中l(wèi)PN及OPN(2PB)胚胎形成的影響因素和發(fā)育潛能,以探尋提高卵母細(xì)胞利用率的可行性方法,方法對(duì)787個(gè)IVF周期和298個(gè)ICSI周期患者授精后l8-20h觀察到的lPN及0PN(2PB)胚胎繼續(xù)進(jìn)行體外培養(yǎng),觀察其原核及卵裂情況,序貫培養(yǎng)。
2、至D6,觀察囊胚形成情況;并回顧性分析這些患者的臨床資料,研究lPN及OPN(2PB)胚胎形成的影響因素。結(jié)果(l)lPN及OPN(2PB)胚胎可卵裂并形成囊胚,但卵裂率(分別為90.l6%和88.ll%)和囊胚形成率(l7.09%和30.03%)均顯著低子2PN胚胎(分別為98.40%和45.7l%)(P均<0.05);(2)lPN胚胎的形成隨患者的年齡、體外受精方式及獲卵數(shù)的不同而不同,而0PN(2PB)胚胎的形成只隨患者年齡不同而異(P<【試管鮮胚移植后幾天能測(cè)出來】0.05);(3)經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),lP。
3、N和0PN(2PB)胚胎的形成與患者選擇的受精方式、MII卵數(shù)、2PN胚胎數(shù)相關(guān)(P<0.05),而與患者的年齡、體重指數(shù)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平及獲卵數(shù)無關(guān)(P<0.05)。結(jié)論患者的體外受精方式、獲得的MII卵數(shù)以及受精后的2PN胚胎數(shù)可能影響到1PN和0PN(2PB)胚胎的形成;lPN及0PN(2PB)胚胎有一定發(fā)育潛能,但較2PN胚胎低;在行補(bǔ)助生殖技術(shù)助孕過程中,應(yīng)綜合考慮各種影響因素,以降低lPN和0PN(2PB)胚胎的發(fā)生率,提高卵母細(xì)胞的臨床利用率。【關(guān)鍵詞】體外受精;單原核(1PN)胚胎;胚囊;發(fā)育潛能;Logistic回歸。
4、在人類體外受精一胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)中,常于授精后16~20h內(nèi)通過光學(xué)顯微鏡對(duì)胚胎原核數(shù)目進(jìn)行觀察及評(píng)分,正常受精的判斷標(biāo)準(zhǔn)為觀察到胚胎內(nèi)存在明確的2PN(pronucleus)及2PB(polarbody)。然而,在胚胎培養(yǎng)過程中,常有相對(duì)較多的異常受精情況出現(xiàn),其中IPN的發(fā)生率約為2%~5%。在臨床治療過程中,1PN及0PN(2PB)胚胎通常被視為異常受精胚胎,與多原核胚胎及發(fā)育停滯的2PN胚胎一起作為廢棄胚胎被銷毀。事實(shí)上,部分1PN及0PN(2PB)胚胎是正常受精的胚胎,只是因?yàn)殄e(cuò)過了最住的觀察時(shí)機(jī),被誤認(rèn)為是異常受精,如果將這類。
5、胚胎全部銷毀,會(huì)造成胚胎資源的浪費(fèi)。本研究回顧性分析787個(gè)IVF周期和298個(gè)ICSI周期患者的1PN及0PN(2PB)胚胎的繼續(xù)培養(yǎng)情況,探討這類“異常受精”胚胎的發(fā)育潛能,同時(shí)分析患者的l1告床資料,研究1PN及0PN(2PB)胚胎形成的影響因素,為降低1PN及0PN(2PB)胚胎的發(fā)生率,提高卵母細(xì)胞利用率提供指導(dǎo)。資料與方法一、臨床資料選擇2014年7月28日至2014年10月31日就診于河南省人民醫(yī)院生殖中心的不孕癥夫婦的臨床資料。。
6、納入標(biāo)準(zhǔn):基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平正常;≤3個(gè)治療周期;HBV及HIV陰性。排除標(biāo)準(zhǔn):生殖泌尿系統(tǒng)急性感染【試管需要多長(zhǎng)時(shí)間完成】或性傳播疾病;嚴(yán)重的遺傳、軀體疾病或精神疾患;吸毒等不良嗜好;獲卵數(shù)<1個(gè);短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救ICSI(Re-ICSI)。本研究共包括787個(gè)IVF周期和298個(gè)ICSI周期的不孕癥夫婦的臨床資料。二、患者診療方法回顧1.促排卵方案及卵母細(xì)胞的采集與處理:接受IVF-ET治療的不孕癥患者采用本中心常規(guī)方案進(jìn)行控制性促排卵,當(dāng)≥3個(gè)卵泡直徑達(dá)18mm時(shí),結(jié)合血清雌二醇(E2)、孕酮(P)值,適時(shí)予以H。
7、CG(麗珠制藥)5000~10000U肌肉注射;36h后在陰道超聲引導(dǎo)下,使用18G取卵針(Cook,瑞典)來集卵冠丘復(fù)合體(OCCC),將其于加有G-MOPS緩沖液(Vitrolife,瑞典)的培養(yǎng)皿中洗滌兩次后,轉(zhuǎn)入含G-IVF-PLUS培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)的培養(yǎng)皿中,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)6%C02、體積分?jǐn)?shù)5%02的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.精子處理:精液處理來用密度梯度離心法。處理后的精子沉淀經(jīng)1m1的G-IVF-PLUS培養(yǎng)液Vitrolife,瑞典)上游后,取上游液分析精子濃度。3.受精:IVF周期患者于取卵后約3。
8、h后行體外授精,加精濃度為每卵05~1萬條精子;精卵共孵育約,1h后機(jī)械剝離顆粒細(xì)胞,轉(zhuǎn)入含有G,-PLUS培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)的培養(yǎng)皿中。ICSI周期患者于取卵后約3h后將孵育后的卵母細(xì)胞經(jīng)透明質(zhì)酸酶(Vitrolife,瑞典)消化后機(jī)械剝離顆粒細(xì)胞,將卵母細(xì)胞置于含有G-IVF-PLUS培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)的培養(yǎng)皿中預(yù)培養(yǎng)1h后,挑選形態(tài)相對(duì)正常的精子對(duì)成熟的卵母細(xì)胞行單精子注射,注射后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入含G1-PLUS培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。4.胚胎觀察及評(píng)分:授精后18~20h于倒置顯。
9、微鏡下觀察受精情況,記錄原核數(shù)目,原核和胚胎形態(tài)學(xué)的觀察參照之前的研究。若觀察時(shí)胚胎出現(xiàn)兩個(gè)原核及兩個(gè)極體,則為2PN胚胎;若只有一個(gè)原核,則為1PN胚胎;若觀察不到原核但有兩個(gè)極體,則為0PN(2PB)胚胎。2PN胚胎于D2和D3在倒置顯微鏡下評(píng)估卵裂期胚胎的形態(tài),包括胚胎細(xì)胞數(shù)、碎片比例、細(xì)胞大小是否均勻等情況,參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)。可利用胚胎為細(xì)胞數(shù)多于4個(gè)且評(píng)分高于2分的胚胎,可繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚;根據(jù)患者的具體情況決定其2PN胚胎的去向:移植、冷凍或是囊胚培養(yǎng)。進(jìn)行囊胚培養(yǎng)的2PN胚胎,于D5和D6對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)估,囊胚分級(jí)的方法為Gardner囊胚分級(jí)法。我中心。
10、可利用囊胚標(biāo)準(zhǔn)為:3BB及以上的囊胚;優(yōu)質(zhì)囊胚標(biāo)準(zhǔn)為:評(píng)分為4AA、4AB、4BA和IBB的囊胚;可利用囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚可進(jìn)行移植或冷凍保存,冷凍的囊胚擇期復(fù)融后進(jìn)行移植。臨床上常規(guī)將1PN胚胎及0PN(2PB)胚胎丟棄。本研究中所有的1PN及0PN(2PB)胚胎均進(jìn)行序貫培養(yǎng),培養(yǎng)至D6,胚胎及囊胚的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)同上。上述整個(gè)過程均取得患者的知情同意且獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。三、觀察指標(biāo)2PN胚胎形成率=(2PN胚胎數(shù)/獲卵數(shù))X100%;2PN胚胎卵裂率=(發(fā)生卵裂的2PN胚胎數(shù)/2PN胚胎數(shù))x100%;2PN。
11、囊胚形成率=(2PN胚胎形成的囊胚數(shù)/進(jìn)行囊胚培養(yǎng)的2PN胚胎數(shù))X100%。相應(yīng)的1PN及0PN(2PB)胚胎的形成率、卵裂率、囊胚形成率來用類似計(jì)算方式。四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)來用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(？土s)或率(%)表示,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),率的比較來用x2檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、患者基本情況分析787例行IVF治療的患者。
12、,年齡為(31.94土563)歲,患者的體重指數(shù)(BMI)為(23.26土3.65)kg/m2;298例行ICSI治療的患者,年齡為(32.11土6.86)歲,患者的BMI為(23.02土7.52)kg/m2。兩組患者的基本資料和基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。IVF治療周期共415個(gè)周期進(jìn)行了移植,共移植了760個(gè)2PN胚胎,臨床妊娠241例;ICSI治療周期有164個(gè)周期移植了264個(gè)2PN胚胎,臨床妊娠102例。二、1PN及0PN(2PB)胚胎形成及繼續(xù)囊胚培養(yǎng)結(jié)局370個(gè)IVF周期的患者出現(xiàn)了1PN和0PN(2。
13、PB)胚胎,形成1PN胚胎305枚,卵裂275枚,形成囊胚47枚;0PN(2PB)胚胎412枚,卵裂363枚,形成囊胚109枚,了1PN和0PN(2PB)胚胎的卵裂率及囊胚形成率均顯著低于2PN胚胎(P35歲組患者比較。
14、,30~35歲組患者的2PN胚胎卵裂率、0PN(2PB)胚胎形成率及其卵裂率較高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而<30歲組患者的0PN(2PB)胚胎卵裂率較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。四、體外受精方式與1PN及OPN(2PB)胚胎形成的關(guān)系體外受精一胚胎移植周期中,常規(guī)IVF周期的平均獲卵數(shù)、1PN及0PN(2PB)胚胎的發(fā)生率均高于ICSI周期(P0.05)(表4)。五、獲卵數(shù)與1P1、1及0P1、1(2PB)胚胎形。
15、成的關(guān)系獲卵數(shù)的中位數(shù)為9枚(1~48枚),以5、10、15、20為界值,對(duì)患者進(jìn)行分組。各組的1PN胚胎形成率及卵裂率以及0PN(2PB)胚胎的形成率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但各組之間2PN胚胎的形成率及卵裂率、0PN(2PB)卵裂率及2PN優(yōu)質(zhì)胚胎率存在顯著性差異(P<0.05)(表5)。六、Logstic回歸分析結(jié)果以是否有1PN胚胎形成為因變量,納入患者年齡、體重指數(shù)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌(FSH、LH、E2、PRL、P、T)水平、受精方式、獲卵數(shù)、MII數(shù)、正常受精數(shù)為自變量,進(jìn)行Logistic回歸分析,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),。
16、P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析發(fā)現(xiàn)，1PN胚胎的形成與患者選擇的受精方式、MII卵數(shù)、2PN數(shù)顯著相關(guān)(P0.05),與IVF周期相比,ICSI周期中更可能出現(xiàn)1PN胚胎(P<0.05);當(dāng)患者的MII卵數(shù)越多,2PN胚胎數(shù)越少時(shí),越易形成1PN胚胎(P<0.05)。同樣,以是否有0PN(2PB)胚胎形成為因變量,進(jìn)行Logistic回歸分析,發(fā)現(xiàn)0PN(2PB)胚胎的形成與患者選擇的受精方式、MII卵數(shù)、2PN數(shù)有關(guān)。
17、(P0.05)。與ICSI周期相比,IVF周期中更可能出現(xiàn)0PN(2PB)胚胎(P<0.05);當(dāng)患者的MII卵數(shù)越多,2PN胚胎數(shù)越少時(shí),越易形成OPN(2PB)胚胎(P<0.05)。討論目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為1PN胚胎可能的發(fā)生機(jī)制主要有以下方面:①孤雌激活;②精子染色體解聚異常;③雌原核形成異常;④雌雄原核融合;⑤雌雄原核形成。
18、不同步;⑥成熟前原核核膜崩解(prematurepronuclearenve1opebreakdown,pPNBD)：最近一項(xiàng)新的研究發(fā)現(xiàn),對(duì)1PN胚胎行FISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其有兩個(gè)原核,這是以上的機(jī)制難以解釋的,進(jìn)一步采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè),證實(shí)了pPNBD的發(fā)生可能是導(dǎo)致1PN胚胎形成的另一機(jī)制。另外,約30%~40%的卵受精18~20h后在倒置顯微鏡下觀察不到原核,只看到兩個(gè)第二極體即0PN(2PB)胚胎,繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn),部分0PN(2PB)胚胎仍可發(fā)生卵裂或是形成胚胎,其外觀形態(tài)和卵裂率與正常受精的胚胎相似,因此未觀察到原核并不意味著未發(fā)生受精,導(dǎo)致0PN(2PB。
19、)形成的原因主要有以下幾個(gè)方面:①雌雄原核發(fā)育不同步;②受精缺陷;③第二極體參與到核遺傳物質(zhì)的形成過程。從上述機(jī)制可以發(fā)現(xiàn),部分1PN及0PN(2PB)胚胎是正常受精的胚胎,只是因?yàn)殄e(cuò)過了最佳的觀察時(shí)機(jī)而導(dǎo)致只觀察到1個(gè)原核或是沒有原核,盡管如此,仍有一部分是異常受精的胚胎。臨床上經(jīng)常會(huì)遇到一些患者,獲卵數(shù)較少,經(jīng)過體外受精后往往無2PN胚月合,而形成了1PN或0PN(2PB)胚胎,對(duì)于此類患者,可進(jìn)行多次原核觀察,以期發(fā)現(xiàn)第二個(gè)原核。但反復(fù)多次地將培養(yǎng)皿取出進(jìn)行觀察會(huì)帶來胚胎生長(zhǎng)環(huán)境的不斷變化,可能會(huì)對(duì)胚胎的正常發(fā)育造成一定的不良影響;此外,多次觀察會(huì)大大地增加胚胎實(shí)驗(yàn)室工作人員的工作。
20、量,而近些年來興起的time-1apse技術(shù)雖然可以在封閉環(huán)境下動(dòng)態(tài)地觀察胚胎發(fā)育情況,但因其價(jià)格昂貴且不能有效地改善妊娠結(jié)局及輔助生殖技術(shù)的安全性,尚未在各個(gè)生殖中心廣泛采用,所以本研究將探討這類胚胎的發(fā)育潛能及可能的影響因素。在本研究中,IPN胚胎的發(fā)生率為3.65%(IVF周期)、3.01%(ICSI周期),與先前報(bào)道的2%~5%相似。與正常的2PN胚胎相比,1PN胚胎的形成在患者基本情況、促排卵方案、胚胎發(fā)育情況等方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。目前有多個(gè)研究對(duì)獲卵數(shù)與ART妊娠結(jié)局之間的關(guān)系進(jìn)行研究,但研究結(jié)果并不一致。有研究證明,1PN胚胎的周期中卵冠丘復(fù)。
21、合體的數(shù)目較多[6],我們根據(jù)獲卵數(shù)的多少對(duì)患者進(jìn)行分組,各組的1PN胚胎形成率及卵裂率以及0PN(2PB)胚胎的形成率均無顯著差異,但2PN的形成率及卵裂率、0PN(2PB)胚胎卵裂率及2PN優(yōu)質(zhì)胚胎率則存在顯著差異,本研究還發(fā)現(xiàn)1PN胚胎的形成可能與MII卵母細(xì)胞數(shù)及本周期中形成的2PN胚胎數(shù)相關(guān),當(dāng)患者本周期的MII卵母細(xì)胞數(shù)較多而2PN胚胎數(shù)目較少時(shí),往往更可能會(huì)出現(xiàn)1PN胚胎,因?yàn)榫兔總€(gè)周期的MII卵母細(xì)胞而言,授精后會(huì)形成0PN(2PB)胚胎、1PN胚胎、2PN胚胎、多PN胚胎,以及1PB胚胎,當(dāng)MII卵母細(xì)胞數(shù)目較多,而其余各種類型的胚胎尤其是2PN胚胎較。
22、少時(shí),則較易出現(xiàn)1PN胚胎,,母方年齡在體外受精一胚胎移植周期中起著關(guān)鍵性的作用.本研究發(fā)現(xiàn),隨著女方年齡的不斷增長(zhǎng),IVF及ICSI授精方式下1PN胚胎的發(fā)生率與卵裂率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而30~35歲的患者0PN(2PB)的發(fā)生率較其他年齡組高,為了進(jìn)一步【試管橡皮筋的作用】探討授精方式對(duì)1PN胚胎形成的影響,對(duì)患者進(jìn)行分組研究結(jié)果顯示,IVF授精方式下1PN及OPN(2PB)胚胎的發(fā)生率均高于ICSI組(P<0.05),而兩組的卵裂率及囊胚形成率并無顯著性差異,這說明兩種授精方式下IPN來源胚胎的發(fā)育潛能無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,有研究表明,對(duì)IVF和ICSI周期中1PN胚胎進(jìn)行熒光原位雜交(FIS。
23、H)后發(fā)現(xiàn),IVF周期中由1PN胚胎發(fā)育來的胚胎,其胚胎性染色體二倍體率為54.35%,單倍體率為23.91%,嵌合體率為21.74%;而在ICSI周期中,分別為34.62%、34.62%和3077%,這表明IVF周期的單原核孕卵有一定的移植價(jià)值,而ICSI中1PN胚胎中大部分是由于孤雌生殖而形成,到目前為止,已有不少來源于1PN或0PN(2PB)胚胎來源的健康子代出生。進(jìn)一步行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),1PN及0PN(2PB)胚胎的形成與女方的年齡、體重指數(shù)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌(FSH、LH、E、PRL、P、T)水平及獲卵數(shù)無關(guān),,而與患者選擇的受精方式、。
24、MII卵數(shù)以及形成的2PN數(shù)有關(guān)。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能與進(jìn)行Logistic回歸分析時(shí)選擇的自變量有限有關(guān),本研究未對(duì)患者的不孕類型(原發(fā)不孕或是繼發(fā)不孕)、超促排卵方案、HCG日的FSH及E2水平、Gn用量等進(jìn)行分析,也未將這些因素納入到研究中,可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的偏差,但Logistic回歸分析的結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并不代表從專業(yè)知識(shí)角度也有意義,所以1PN及0PN(2PB)胚胎形成的危險(xiǎn)因素尚需進(jìn)一步的研究。有研究認(rèn)為1PN胚胎極有可能存在染色體異常,胚胎質(zhì)量較差,發(fā)育潛能較低,多數(shù)胚胎存在發(fā)育停滯,只有約3o%發(fā)育至桑椹胚或囊胚,故認(rèn)為其不具有臨床價(jià)值，常作為廢胚。
25、丟棄，僅在個(gè)別無正常受精的2PN胚胎的情況下考慮使用。本研究對(duì)IVF/ICSI周期受精后18-20h觀察到的1PN及0PN(2PB)胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)至D6,并于D5、D6觀察其囊【試管鮮胚移植第五天有沒有測(cè)出來的】胚形成情況,發(fā)現(xiàn)1PN和0PN(2PB)胚胎有相當(dāng)比例可發(fā)育成嚢胚,但與2PN胚胎相比,其卵裂率及囊胚形成率均明顯降低,說明1PN及0PN(2PB)胚胎具有一定的發(fā)育潛能,但發(fā)育潛能較低,與以往的研究結(jié)果相似。綜上所述,1PN和0PN(2PB)胚胎具有一定的發(fā)育潛能,其形成可能受授精方式、MII卵母細(xì)胞數(shù)等因素的影響。本研究并未對(duì)這些“異常胚胎”進(jìn)行染色體分析,也并未對(duì)患者移植這些胚胎,因此,關(guān)于IVF-ET中單原核來源的胚胎是否具有利用價(jià)值,尚需進(jìn)一步的研究來證實(shí)。。
